成管實驗二最合適的培養基

一、實驗材料

細胞：人臍靜脈內皮細胞

培養基：ECM專用培養基、含10%ABW胎牛血清的DMEM完全培養基、含10% ABW胎牛血清的1640完全培養基、DMEM基礎培養基

耗材：預冷槍頭、預冷 96 孔板和預冷1.5毫升離心管

其他：胰酶，PBS，Matrigengel（ABW貨號：0827045/0827065，金牌基質膠）

二、實驗步驟

A.實驗準備

1.實驗過程中所需耗材包括但不限于：10微升、200微升、1毫升移液槍槍頭；凍存管或1.5毫升離心管；小鑷子。耗材需要高壓滅菌并烘干后置于-20℃-4℃環境中預冷。

2.提前打開制冰機，用冰盒裝滿冰。

3.提前24小時將基質膠放置在冰盒里，并將冰盒置于4℃冰箱，在此期間盡量減少開關冰箱門。

B.準備基質膠

1.實驗前將基質膠、槍頭、1.5毫升離心管和96孔板置于冰盒中預冷。

C.鋪基質膠

1.取1.5毫升離心管，按以下比例配基質膠。

240微升原膠+120微升 DMEM基礎培養基

2.混勻基質膠后，在96孔板中按照每孔50微升的量加入，避免產生氣泡。（注：可以將槍頭剪短前端，移液器打到一檔比較不容易出現氣泡。若是有氣泡，可以對準氣泡，用槍將氣泡吸上來或者戳破氣泡。配膠時可以按比例多配一點，不要剛好每孔配50微升。）

3.在37℃ 5%二氧化碳培養箱中放置1小時。

D.鋪細胞

1.棄上清：當人臍靜脈內皮細胞在培養皿中生長至70~80%時，吸去培養液上清。

2.清洗：用1毫升PBS清洗懸浮死細胞。

3.消化：用胰酶消化下來，用含10%ABW胎牛血清的完全培養基終止消化（10厘米皿用1毫升胰酶，1毫升含10%ABW胎牛血清的DMEM完全培養基終止消化，6厘米皿用500微升胰酶，500微升含10%ABW胎牛血清的 DMEM完全培養基終止消化。具體用量根據自己需要。）

4.離心：轉移至3個1.5毫升離心管，1200轉數，5分鐘離心。

5.分別用1毫升ECM專用培養基、1毫升含10%ABW胎牛血清的 DMEM完全培養基、1毫升含10%ABW胎牛血清的1640完全培養基重懸。

6.計數：分別吸取10微升于計數板，用細胞計數儀進行計數，調整細胞密度為30000個細胞/孔

7.按照每孔加入50微升重懸液加入凝膠好的96孔板中。

8.在5％二氧化碳37℃培養箱孵育4小時、24小時。

E.觀察結果，拍照。