Transwell實驗——基本操作

一、基本原理：

Transwell小室在培養板中，小室內稱上室，小室放入的培養板稱下室，上室底部為一層聚碳酸酯膜，這層膜具有通透性，將上室培養液和含下室培養液隔開，下室中的培養液可以影響上室中的細胞，從而研究下室中液體對細胞的生長、遷移的影響，細胞接種到低營養的培養液里，通常膜孔都被ABW^@Matrigengel覆蓋，模仿細胞外基質，腫瘤細胞必須分泌水解酶并通過變形運動才能穿過鋪有ABW^@Matrigengel的濾膜，計數進入下室的細胞量可反應腫瘤細胞的侵襲能力。

應用不同孔徑和經過不同處理的聚碳酸酯膜，就可以進行共培養、細胞趨化、細胞遷移、細胞侵襲等多種方面的研究。

 

二、實驗儀器和材料  

細胞：SGC-7901

培養基：1640基礎培養基，含10%ABW胎牛血清的1640完全培養基（ABW血清貨號：AB20214403）

耗材：預冷槍頭、預冷1.5毫升離心管和放有8微升Transwell小室的預冷24孔板

其他：胰酶，PBS，0.1%結晶紫染液，4％多聚甲醛，Matrigengel（ABW貨號：0827045）

 

三、實驗步驟

 

A.配培養基：5毫升ABW胎牛血清+500微升雙抗+44.5毫升1640基礎培養基混勻于50毫升離心管。

 

B.準備基質膠

1.在冰上4℃過夜融化Matrigengel，實驗前轉移到冰盒中。（注意：準備-20℃預冷的槍頭用于吸取Matrigengel）

2.將槍頭、1.5毫升離心管、放有Transwell小室的24孔板和1640基礎培養基放入冰盒中預冷。

 

C.基質膠鋪板（冰上操作）

1.稀釋Matrigengel：先將8微升 Matrigenge加入預冷的1.5毫升離心管中，然后加入64微升預冷的1640基礎培養基，并用槍頭吹打充分混勻。（Matrigenge和基礎培養基以1:8的比例稀釋）

2.吸取60微升稀釋后的Matrigengel，垂直加入Transwewll上室中，均勻平鋪在底部。另吸取60微升1640基礎培養基于小室中，作為空白對照。放入培養箱（37℃，5%CO₂)中孵育3h，使Matrigengel聚合成薄膜。（注意：鋪膠過程不要產生氣泡，均勻鋪膠。）

3.孵育后將上室中多余液體吸掉，在每孔中加入100微升1640基礎培養基后，于培養箱放置30 分鐘，進行基底膜水化。

4. 將上室中多余液體吸掉，準備接種細胞。

 

D.制作細胞懸液

1.制作細胞懸液前可先讓細胞撤血清饑餓12-24h，進一步去除血清的影響。（此步驟可選擇操作，如果細胞遷移能力不強，可考慮進行此步驟增加血清對細胞的誘導。）

2.取匯合度達70%-80%的細胞進行消化并離心棄廢液，然后用1640基礎培養基重懸細胞，計數后調整細胞密度至每孔5萬個。（可根據不同細胞系Transwell遷移實驗的細胞密度進行調整。）

 

E.接種細胞

1.在24孔板下室加入500微升含10%ABW胎牛血清的1640完全培養基。然后用鑷子將Transwell小室置于24孔板內（注意：下層培養液和小室間經常會有氣泡產生，一旦產生氣泡，下層培養液的趨化作用就減弱甚至消失了，在種板的時候要特別留心，一旦出現氣泡，要將小室提起，去除氣泡，再將小室放進培養板。）

2.每孔加入200微升細胞懸液到Transwell上室中。

3.培養箱培養24h后可進行固定染色。（時間點可根據腫瘤細胞侵襲能力而定，一般24-48h，還需要考慮細胞狀態和消化時間對細胞的影響。另外建議最好接種細胞后1-2h把培養板從培養箱里拿出來看看，確保沒有大氣泡產生。）

 

F.細胞固定

1.取出Transwell小室，吸走培養基，用棉簽輕輕擦拭Matrigengel和上室內的細胞。

2.在24孔板干凈的孔中加入4％多聚甲醛600微升，將小室放入后固定20-30分鐘。

 

G.細胞染色及計數

1.棄去固定液，將小室在盛有PBS的6厘米皿中涮洗1遍。（注意避免觸碰到小室底部）

2.用0.1%結晶紫染色5-10分鐘，PBS涮洗3遍，除去未與細胞結合的結晶紫，用棉簽輕輕擦拭小室的上側，將非特異性結合于小室上表面的染料擦掉，以便后續鏡檢。

3.適當風干后，在10倍顯微鏡下選取5個視野觀察細胞并計數。